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DAWN

Wyatt Technology

Dawn è il più moderno ed avanzato strumento per la caratterizzazione assoluta di proteine, coniugati, macromolecole e nanoparticelle, che utilizza la tecnica della diffusione della luce.
Il DAWN è il primo detector Multi-Angle static Light Scattering (MALS), per la caratterizzazione assoluta di macromolecole e nanoparticelle in soluzione, con la più alta sensibilità ed il più ampio intervallo di pesi molecolari, dimensioni misurabili anche a basse concentrazioni.
Il DAWN è spesso utilizzato in accoppiamento con la Size Exclusion Chromatography (SEC-MALS) o Field-Flow Fractionation (FFF-MALS) per determinare la distribuzione della massa, dimensione e composizione senza dover ricorrere alla calibrazione delle colonne con standard di riferimento.
Il DAWN è gestito dal software ASTRA, il pacchetto software più versatile per l’analisi on line con il Mals ed il dynamic light scattering.

Descrizione

Il DAWN  e l’ Optilab  (detector ad indice di rifrazione) sono gli strumenti di riferimento per l’analisi SEC-MALS, citati in migliaia di pubblicazioni, e, con l’aggiunta del viscosimetro differenziale ViscoStar  si ha un sistema a tripla rivelazione in grado di fornire informazioni sulla conformazione di macromolecole con dimensioni < a 10 nm, e determina i coefficienti di Mark-Houwink Sakurada. La combinazione di un rivelatore UV/Vis con il DAWN e L’Optilab DRI, crea un sistema tripla rivelazione, che è in grado di caratterizza copolimeri, coniugati proteici (Glicoproteine, Proteine coniugate con PEG, proteine di membrana, ecc.). L’aggiunta del modulo WyattQels DLS che, oltre a misurare il Rh on line consente di analizzare la conformazione della proteina. Il DAWN può essere usato anche in batch mode (off-line) per ottenere il peso molecolare medio ponderale, il raggio di girazione ed il secondo coefficiente del viriale (A2) di campioni non frazionati.

  • Mw da 200 Da a 1000 MDa.
  • Sensibilità: 20 ng/ml PS in THF (100KDa); 0.4 µg/mL BSA (66.4 kDa).
  • rg da 10 a 500 nm, fino a 1000 nm con specifici modelli di calcolo.
  • Laser ad alta potenza ultra stabile.

Interfacciato al Sistema Calypso II CG-MALS, il DAWN caratterizza interazioni intramolecolari, senza dover derivatizzare od immobilizzare i composti, si possono studiare l’affinità, la stechiometria, e la omo od etero associazione di sistemi semplici o complessi. Il sistema Calypso automatizza, inoltre, la misura del secondo coefficiente del viriale, e dei coefficienti del viriale dovuti all’interazione, massa molecolare media e dimensione. 

  • Pulizia della cella con ultrasuoni.

Il DAWN viene fornito con il COMET – Trasduttore ad ultrasuoni, integrabile nella cella del MALS, gestibile dal software ASTRA, pulisce la cella automaticamente, agitando il fluido all’interno con conseguente rilascio di eventuali particelle adese.

  • Controllo della Temperatura.
  • Modello standard che lavora a Temperatura ambiente.
  • Modello Ultra-High-Temperature (UHT), da ambiente fino a +210°C.
  • Modello Standard termostatato con Peltier con controllo di temperature da -15°C a +150°C.

OPZIONI

Dynamic Light Scattering

  • WyattQELS – Modulo per misure di dynamic light scattering (DLS), che si integra all’interno del DAWN, per misurare simultaneamente Mw, Rg, Rh, nello stesso volume di scattering. La fibra ottica, per raccogliere il segnale di luce diffusa generato dai movimenti browniani, viene installata a 50.5°, 90°, 135° o 150°, il software ASTRA determina automaticamente la posizione
  • DynaPro NanoStar – Principalmente utilizzato per misure DLS in batch, il NanoStar può svolgere la doppia funzione anche di rivelatore DLS on-line, installando la sua fibra ottica in una qualunque delle posizioni del DAWN.

Laser

Il laser standard a 658 nm, con emissione nel rosso, può essere sostituito con un laser infrarosso a 785 nm. Il laser IR previene o minimizza l’eventuale emission per fluorescenza da parte del campione, utile per quelle molecole che hanno emissione per fluorescenza al di sotto dei 658 nm.

On-line Mals

Il DAWN può essere interfacciato con tutti i sistemi, GPC, HPLC o FPLC standard presenti sul mercato per l’esecuzione di analisi di massa molecolare assoluta, dimensioni e loro distribuzioni; o per studi di conformazione o per caratterizzazione di coniugati. Tutti queste elaborazioni dati sono eseguite con il software ASTRA il quale acquisisce ed elabora I dati in funzione dei parametri da ricercare. Per quei sistemi cromatografici in cui sia presente un rivelatore UV, fluorimetro o altro rivelatore a concentrazione, il DAWN accetta fino a 4 segnali analogici provenienti dai rivelatori ausiliari.

In molti casi è utile utilizzare come rivelatore a concentrazione il rifrattometro differenziale Optilab T-rEX. Il rifrattometro è un detector universale la cui risposta dipende solo dalla concentrazione e non dalla presenza di cromofori o fluorofori. La combinazione dei segnali Mals, UV ed RI è utilizzata da ASTRA per eseguire l’analisi di complessi coniugati binari, quali glicoproteine, Proteine PEGilate o co-polimeri a blocchi.

Il DAWN può essere anche interfacciato con il Sistema per FFF Eclipse per la caratterizzazione di macromolecole e nanoparticelle da 1 nm ad 1 µm via FFF-MALS. Sia la SEC-MALS che FFF-MALS possono beneficiare del modulo WyattQELS per la misura di dimensioni a livello nano via dynamic light scattering (DLS). Il WyattQELS utilizza lo stesso laser e lo stesso volume di scattering del Mals. La fibra ottica è agevolmente inserita nella testata di lettura, rimpiazzando uno dei 18 detector Mals del Dawn.

Per l’analisi di polimeri sintetici e naturali può essere aggiunto al sistema anche il rivelatore Viscosimetrico ViscoStar II, la viscosimetria differenziale è una tecnica ortogonale per determinare la massa molecolare e la conformazioni.  

BATCH MALS

I detector MALS possono lavorare in batch (su campioni non frazionati) se il campione non necessita una separazione in frazioni: se il campione non è frazionabile in SEC o FFF, è possibile misurare la massa molecolare media e la dimensione media Rz con una misura Mals in batch. Per validare misure di SEC-MALS:

  • al fine di determinare se grossi aggregati od altre specie che non vengono frazionate in colonna.
  • al fine di determinare aggregati reversibili che si possono dissociare a causa della diluizione nella colonna SEC o nel canale di separazione della FFF.
  • Per caratterizzare complessi macromolecolari o di nanoparticelle che possono essere distrutti dalle forze di in Colonna o dalla diluizione.
  • Per misurare l’affinità di legame o cinetiche di reazione di macromolecole quali ad esempio interazione proteina-legante.

 

  • Calypso II – accoppiato la Mals consente di preparare il campione e condure la cosiddetta analisi di Composition Gradient Mals per misurare le interazioni a concentrazioni differenti fra biomolecole, interazioni fra proteine, Zimm plot e misura di dn/dc. Il software del Calypso è stato sviluppato per analizzare le interazioni.
  • microCUVETTE – Consente misure di light scattering sia statico che dinamico, condotte simultaneamente nella cella Mals in una cuvetta di quarzo del volume di 10 µL.
  • NanoFilter Kit – Rende facile la filtrazione il recupero e la ri filtrazione di campioni molto preziosi. E’ specialmente consigliato per volumi di campione inferiori ai 300 µL.
  • Microbatch Kit – Usato per iniettare I campioni nella cella a flusso del Mals, e nella determinazione del dn/dc con l’Optilab.

Software

  • ASTRA – E’ il software proprietario Wyatt per l’acquisizione ed elaborazione dati per l’analisi MALS e DLS in cromatografia, AF4 o batch, e viene fornito con ogni rivelatore. ASTRA è disponibile nella versione 21CFR(11) ed offre opzioni aggiuntive quali l’analisi di particelle, la caratterizzazione dei coniugati e molto altro.
  • CALYPSO – Software per la gestione del Sistema CG-Mals, per l’esecuzione di esperimenti in cui viene variata automaticamente la composizione del campione. Controlla il Calypso II, l’acquisizione dati, e l’analisi per la determinazione delle interazioni fra biomolecole, cinetiche di reazione, cosi come la misura in batch della massa molecolare del raggio e del secondo coefficiente del viriale.
Caratteristiche Tecniche

Misure Mals

Intervallo Massa Molecolare

200 Da a 1000MDa

Intervallo di dimensioni (rg)

10 nm – 500 nm, fino a 1000 con specifici modelli di calcolo

Intervallo di dimensioni (Rh)

Dipende dall’angolo di scattering I flusso 0.5 nm-300nm, in batch 0.5nm fino a 1mm

Sensibilità

200 ng/mL BSA, 20 ng BSA tipico loading in HPLC

10 ng di Polistirene 100 kDa in THF

Fluidica

Il materiale in contatto con fase mobile e campione è Acciaio AISI 316, Kalrez quarzo

Ottica

Detectors Mals

18 Detectors a 18 angoli differenti id misura ad alto gain, alto range dinamico

Detectors Ausiliari

Detector per monitorare l’emissione del laser, Forward monitor per correggere il segnale in caso di assorbimento del campione

Risoluzione A/D

24 bit (range dinamico del rivelatore >16000)

DLS per misura delle dimensioni

Possibile con il modulo opzionale WyattQels installato, in alternativa usando la fibra ottica del DynaPro Nanostar

Specifiche del Laser

Controllo Potenza del laser

Programmabile dal 10% al 100%

Lunghezza d’onda

λ = 658 nm (nominale) ogni strumento è individualmente fornito di certificato

 

Cella a Flusso

Silice fusa per solventi con indice di rifrazione inferiore a 1.5 e cella F2 per solventi con indice di refrazione superiore a 1.5

Temperatura di lavoro della cella

Ambiente

Termostatata con Peltier -15 °C - +150°C

UHT da Ambiente fino a 210 °C

Elettronica

Ingressi Analogici

4 diversi segnali analogici in entrata a 24 bit

Uscite analogiche

2 uscite analogiche -10v a +10V

Altri Ingressi/Uscite

Alarm IN, chiusura di contatto da autocampionatore, Recycle IN

Ritrasmissione di Alarm, Autocampionatore e Recycle

Display frontale

Touch screen da 162.5 mm, 16-bit, ad alta risoluzione più tastiera

Interfaccia PC

Ethernet

Velocità trasmissione dati

Selezionabile da software da 36.6 Hz a 0.0001 Hz

Dimensioni

60 cm (L) x 36 cm (P) x 23 cm (H)

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